• 专利附录
  • 专利说明
  • 权利要求
  • 类似技术
  • 同族专利
  • 引用文献
  • 法律状态
  • 优先权
    • 专利摘要:

    公开号:WO1984003300A1
    申请号:PCT/SU1984/000007
    申请日:1984-02-23
    公开日:1984-08-30
    发明作者:Valdis Martynovich Berzin；Alexandr Jurievich Tsimanis；Jury Ivanovich Vishnevsky；Uldis Rudolfovich Apsalon；Andris Valdisovich Dishler；Elmar Yanovich Gren；Evgeny Davydovich Sverdlov；Galina Sergeevna Monastyrskaya；Sergei Anatolievich Tsarev；Alexandr Anatolie Smorodintsev；Vladimir Ivanovich Iovlev；Guna Yanovna Feldmane；Arnis Ernestovich Duk
    申请人:Inst Organicheskogo Sinteza Ak；Inst Bioorg Chimii；
    IPC主号:C07K14-00
    专利说明:
    [0001] ЛΕЙΚΟΙЩГΑΡΗЫЙ ЧΕЛΟΒΕЧΕСΚИЙ ИΗΤΕΡΦΕΡΟΗ л И СПΟСΟБ ΕГΟ ПΟЛУЧΕΗИЯ Β ΕΑΚΤΕΡИΑЛЬШΧ ΚЛΕΤΚΑ2 Οбласτь τеχяиκи Ηасτοящее изοбρеτение οτнοсиτся κ геннοй инженеρии, а τοчяее κасаеτся нοвοгο лейκοциτаρяοгο челοвечесκοгο инτеρφеροна н и сποсοба егο ποлучеяия в баκτеρиальяыχ κлеτκаχ»
    [0002] Пρедшесτвующий уροвеяь τеχниκи Инτеρφеροш, в τοм числе лейκοциτаρный инτеρφеροн, πρедсτавляюτ сοбοй κласс иядуцибельяыχ белκοв ποзвοнοч- ныχ, προявляющиχ анτивиρусную и аяτимиκροбную аκτивнοсτь, учасτвугощиχ в ρегуляции иммунοлοгичесκиχ ρеаκций κлеτκи и οбладающиχ ρадиοπροτеκτορным и προτивοοπуχοлевым дей- сτвием. Лейκοциτаρные инτеρφеροяы челοвеκа сοсτазляюτ мульτигеннοе семейсτвο с не менее двенадцаτью членами, чτο дοκазанο аяализοм сτρуκτуρы χροмοсοмнοй ДΗΚЙ Κ-ДΗΚ, синτезиροваянοй яам^ΡΗΚ инτеρφеροнοв, а τаκже анализοм амияοκислοτяοй ποследοваτельнοсτи иядивидуальныχ белκοв из геτеροгеняοй смеси лейκοциτаρныχ ияτеρφеροнοв челοвеκа. Извесτяы ρазличные лейκοциτаρные челοвечесκие ияτеρ- φеροны, ποлучеяяые πуτем геннοй инженеρии, наπρимеρ ин- τеρφеροя Α, προдуциρуемый ρеκοмбинанτяοй ДΗΚ в κлеτκаχ
    [0003] Ε сοϋ /Οοеάάеϊ Б. У. еЬ аϊ , Ηитаη ΙеикοсуЬе ι -Ье егοη ρгοάисесϊ . Ъу Ε. сοϋ ϊз Ыο1ο§ιса11у ас"Ыνе , Νа"Ьиге, 1980 , 282, 411-416/ или лейκοциτаρный челοвечесκий инτеρφеροн " /Οвчиняиκοв Ю.Α. и дρуτие "Пρямая эκсπρессия гена челοвβ- чесκοгο лейκοциτаρяοгο инτеρφеροна Ρ Β κлеτκаχ Ε сοϊϊ" , Дοκлады Ακадемии науκ,Ι982, 265, 238-242/, πρедсτавляющий сοбοй белοκ, сοсτοящий из 166 аминοκислοτ сο следующеϊ ποследοваτельяοсτью: σϋьρд зъσΝΗΕΑЪϊьι-Αдмσнιзρρзσз БΗΗББ'θΡдΕΕΡБαждρдκΑαΑΙзν
    [0004] ЬΗ ΜϊддΤΡΗЬΡ5ΤΚБ55 Τ ν д5ЬЬΕΚΡЗΤΕΙ-ΝςςЬ)ΙБΜ Сνϊд ν νΕΕ Ι-Μ ΝνБ5ΙЬΑν ΚΥΡдΗΙΤЬΥΙΤΞΚΚΥ5Ρσ : ΞννΚ βΙ Κ5Ρ5Ь5 ΙΡдΞΗЬйΗΚ
    [0005] Α - аϊа ; С - суз ; Τ) - ааρ ; Ε - §1и Ρ - ρЬ.е ; - §1у; Η - Ыз ; I - ϋе; Κ - Ιуз ; Ъ - Ιеи; Ш - те"Ь - азη; Ρ - ρгο С} - §1η ; Η - аг§; 5 - зег; Τ - "Ыιг V - νаϊ ; Ψ - "Ьгρ ; Υ - "Ьуг. - 2 -
    [0006] Для ποлучеяия уκазаннοгο инτеρφеροна суммаρяунз ияφορмациοяяую ΡΗΚ ποлучаюτ из лейκοциτοв челοвечесκοй κροви, иядуциροванныχ виρусοм Ηьюκасτля, гуанидияχлορид- -гуанидияτиοциаяаτяым меτοдοм. Пοли-Α φρаκциюмτΡΗΚ ποлу- чаюτ двуκρаτнοй οчисτκοй на οлигο-άΤ-целлюлοзе. Синτез κ-ДΗΚ προвοдяτ, исποльзуя синτеτичесκий οлигοяуκлеοτщд, κοмπлемеяτаρяыи геяу инτеρφеροна в οбласτи τеρминации τρаясляции. Синτез вτοροϊ цеπи οсущесτвляюτ с ποмοщью φρашеяτа Κленοва ДΗΚ-ποлимеρазы I. Пοлучеяную τаκим οό- ρазοм двуχцеποчечную ДΗΚ ποсле ρеκοясτρуκции всτρаиваюτ в веκτορную πлазмиду ρΒн 322 ποд κοяτροлем τρиπτοφанοвο- гο προмοτορа. Уκазаянοй ρеκοмбияаяτяοй πлазмидοй τρансφορ- миρуюτ κлеτκи Ε.ΟΟΙΙ.
    [0007] Уκазанные лейκοциτаρные челοвечесκие ияτеρφеροяы οτ- личаюτся мелщу сοбοй κаκ πο эφφеκτивнοсτж ποдавления ци- τοπаτжчесκοгο дежсτвжя οднοгο и τοгο же виρуса, τаκ и πο аκτивнοсτи προτив ρазличныχ виρусοв. Ρасκρыτие изοбρеτения Β οснοву изοбρеτения ποлοжена задача сοзданжя нοвο- гο лежκοцжτаρнοгο челοвечесκοгο инτеρφеροна, οбладающегο сπециφичнοсτью анτивиρуснοгο и анτиπροлиφеρаτивнοгο дей- сτвия.
    [0008] Заявляемый лежκοциτаρный челοвечесκиж инτеρφеροн ж являеτся яοвым и в лиτеρаτуρе не οπисан. Задача ρешена τем, чτο, сοгласнο изοбρеτенжю, заяв- ляемый инτеρφеροн πρедсτавляеτ сοбοй белοκ сο следую- щей аминοκислοτнοи ποследοваτельнοсτью: СБЬΡдτнзьαшϊ ьιι-ι-Αдм&нιзнρзсжБйΥБ αρραжνΡБ^αρдκ ςΑϊзΑΡ
    [0009] ΗЖϊдςϊΡЖЬΡЗΪΚΒЗЗΑ ТОΕΙΙ БΚΡ ΙΒ^Ρдαы^ЬБ СνταЬΤανΕΕΙ ^Ε ϋЗΙЬΑ7ЖУΡдΗΙ ЬΥ С ΥЗ СΑ 7ΕΥ ΗΑΞΩйЗΡ35'З ϊдκσЬШ Β
    [0010] Заявляемыи яοвый лейκοциτаρный челοвечесκиж инτеρ- φеροн ιг οбладаеτ сπециφичнοсτью анτивиρусяοгο и аяτи- προлиφеρаτивнοгο дейсτвия. Иеποльзοваяие эτοгο яοвοгο ви- да инτеρφеροяа ποзвοлжτ ρасшжρжτь аρсенал сρедсτв для селеκτивяοгο вοздейсτвия на виρусы и злοκачесτвеняые οб- ρазοвания.
    [0011] Сποсοб ποлученжя заявляемοгο лейκοциτаρнοгο челοве- чесκοгο ияτеρφеροна ж,вκлючающшϊ выделение маτρичнοи ποлж (Α)-м-ΡΗΚ из индуциροваняыχ лейκοциτοв челοвеκа, ζνκεΑϊ - 3 - синτез геяа жнτеρφеροяа, всτρаиваяие в веκτορяую πлаз- миду ρБΕ 322 ποд κοнτροлем τρиπτοφаяοвοгο προмοτορа и τρансφορмацжю ποлучеяяοй ρеκοмбжнанτнοй ДΗΚ κлеτοκ баκ- τеρий Ε. сοϊϊ, в κοτοροм, сοгласяο изοбρеτению, в κачесτ- ве гена инτеρφеροяа исποльзуюτ ген инτеρφеροна ιг сο сле- дующей πеρвичнοй сτρуκτуροй ДΗΚ: τοτ ΟΑΤ στο σστ ΟΑΟ ΑСΙ СΑС Αοσ σια οοτ ΑΑΙ ΑΟΟ ΑΟΟ σσσ τια ΑΤΑ στσ στο σσΑ ΟΑΑ ΑΙΟ ΟΟΑ ΑΟ-Α Αϊσ τστ СΑΙ τισ гсс τσσ στσ ΑΑΟ ΟΑΟ ΑΟΑ ΤΑΤ ΟΑΤ ττσ οσ ττσ σσσ ΟΑΟ ΟΑС στσ ΤΤΤ"ΟΑΪ σσσ ΑΑσ СΑΟ ττσ ΟΑΟ ΑΑ σστ σΑ σσσ дτσ τστ σσσ ττσ σΑΤ ΟΑΟ Ατσ дτσ σΑ ΟΑΟ Ασσ ττσ ΑΑΙ στσ ττσ Αα ΑΟΑ Α ΟΑΤ ΤΟΑ τστ σστ σστ τσσ ΟΑΤ ΟΑΟ дσσ στσ στд σ-Ασ ΑΑΑ ττσ Τ ΑΤΤ ΟΑΑ σττ ττσ ΟΑΟ σ στσ ΑΑΤ ΟΑС СΤΑ СΑΑ σσσ τστ στσ ΑΟΑ ΟΑΟ ΟΑΟ сττ σσσ στσ ΟΑΑ ΟΑΟ ΑΤΤ σσσ στσ ΑΤΟ ΑΑΤ ΟΑΟ ΟΑС τσσ Αϊσ στσ οστ οτο ΑΟΟ ΑΑΑ ΓΑС ΤΙΓ ΟΑΑ ΑΟΑ ΑΤΟ ΑСΤ σττ ΤΑΤ στο ΑΙΟ ΟΟΟ ΑΑΟ ΑΑΑ ΤΑС ΑΟС σστ τοτ οσσ шοο ΟΑΟ ατг οτσ ΑΟΑ ΟΟΑ ΟΑΑ ΑΤΟ ΑΤΟ ΑΟΑ ισσ ττσ τστ τττ
    [0012] ГСΛ ΑСΑ ΑΑС ГΤΟ 0ΑΑ ΑΑΑ ΟΟΑ ΙΤΑ ΑΟΑ Α00 ΑΑΟ ΟΑΤ
    [0013] Ιучшжи ваρжаяτ ρасκρыτия изοбρеτеяжя
    [0014] Для лучшегο ποнимаяжя яасτοящегο изοбρеτения πρивο- диτся следующий πρимеρ οсущесτвления сποсοба ποлучения лейκοциτаρнοгο челοвечесκοгο инτеρφеροнаΗ" в баκτеρиаль- ныχ κлеτκаχ. Ιϊρимеρ.
    [0015] I. Βыделенже, οчисτκа и χаρаκτеρжсτиκа ποли (Α)- -м-ΡБΚ
    [0016] 1,4-Κг^ иядуциροваяныχ виρусοм Сендай οчищеняыχ .
    [0017] ЛеЙΚΟЦИΤΟΒ κρθΒИ челοвеκа (Саη-Ьеϊϊ Κ.е-Ь аϊ., Μе-Ыι.Εηζ., 1981, 28, ρаг-ь Α, 29-38) ποсле 4,5 часοв жнκубации οсаж- даюτ ценτρиφугжροванием (30 мжн, 1500 οб/мин) и сусπея- диρуюτ в 100 мл 0,85% ΚаСϊ. Пοлж (Α)-ΗУΙ-ΡΗΚ жз сусπензжи лежκοциτοв выделяюτ и οчшцаюτ πο οπисаннοй меτοдиκе (Ιаβа-Ьа 3. е* аϊ. , Νа-Ьиге, 1980, 284. 316-320) , вκлючаю- щей аφφияяую χροмаτοгρаφию яа οлигο-а.τ -целлюлοзе, φρаκ- циοниροвание в лияейяοм гρадиенτе 5-20 ) саχаροзы и κοнценτρиροвание 12 з φρаκции на οлигο-аτ - целлюлοзе. Κρиτеρием κачесτва ποли (Α)-м-ΡΗΚ служжτ ее маτρичная - 4 - аκτивнοсτь в οοциτаχ Χеηοриз ϊаеν±з, κοτορая сοсτавляеτ 3000 ед.аκτ.инτеρφеροяа яа мκг ΡБΚ πρи сρеднем выχοде 4-5 мκг 12з ποли (Α)-**м-ΡΗΚ.
    [0018] 2. Сжнτез κ-ДΗΚ на маτρице ποлж (Α)-м-ΡΗΚ а) Сжнτез οдяοцеποчечяοй κ-ДΗΚ
    [0019] Ρеаκциοнная смесь (600 мκл) сοдеρжиτ: 50 мΜ τρис-ΗСЬ _(ρΗ 8,1), 6 мΜм_С12, 5 мΜ диτиοτρеиτ, 150 мΜ ΚСΙ, смесь Ρнϊа. СΤΡ, αΑΤΡ, йΤΤΡ, сйΤΡ- 0,5 мΜ κазκдοгο, 7 мκг/мл ποли (Α)-м-ΡΗΚ, 20 мκг/мл οлигο
    и 200 ед.аκτукл οбρаτяοй τρаясκρиπτазы Шν. Ρеаκцию προвοдяτ в τечеяие I часа πρи 42°. Пο οκοячаяии сияτеза κ смесж дοбавляюτ ЭДГΑ /эτжленджамжяτеτρаацеτаτ/ дο κοяценτρациж 10 мΜ, смесь деπροτеинизиρуюτ οдним οбъемοм φенοл - СΗСϊ^ (1:1) и вοдную сρеду προπусκаюτ чеρез κοлοнκу (0,4*15 см) с се-5 φадеκсοмδδθ в 10 ьϋ τρис-ΗСΙ- (ρΗ 7,5), 0,25 Μ ϊГаСϊ.
    [0020] Κοмπлеκс κ-ДΗΚ с ποли (Α)-м-ΡΗΚ из φρаκций οсаждаюτ эτи- лοвым сπиρτοм и οсадοκ ρасτвορяюτ в 50 мκл Η^Ο. Κ ρасτвο- ρу дοбавляюτ 5,1 мκл 5Ν ρасτвορаϊ&ΟΗ и ποсле инκубации •. в τечение 40 минуτ πρи 20° ρасτвορ яейτρализуюτ 8,5 мκл0 3 Μ ацеτаτа яаτρия (ρΗ 4,5) , дοбавляюτ 30 мκл Η^Ο и οд- нοцеποчечную κ-ДΗΚ οсаддаюτ эτилοвым сπиρτοм. б) Сияτез двуχцеποчечяοж κ-ДБΚ Οсадοκ οднοцеποчечнοж κ-ДΗΚ ρасτвορяюτ в 100 мκл ρе- 5
    лимеρазы I /φρаιменτ Κленοва/ и инκубиρуюτ в τечение 30 мияуτ πρж 37°. Пο οκοячанжж ρеаκцжж προдуκτ синτеза0 выделяюτ κаκ οπисанο в ρазделе 2а. Пοсле χροмаτοгρаφии на сеφадеκсе &50 высοκοмοлеκуляρную φρаκцию πеρевοдяτ в ρасτвορ /850 мκл/, еοдеρнащии 30 мΜ ацеτаτа наτρия (ρΗ 4,5), 0,3 ΜϊГаΟΙ, 3 ΉΜ. ΖηЗΟ^ , 2 мκг/мл τ-ΡΗΚ Ε. сοϊϊ и 115 ед.аκτ./мл нуκлеазыБд*. Смесь инκубиρуюτ в τечение5 30 минуτ πρи 37° и двуχцелοчечяую κ-ДΗΚ выделяюτ κаκ οπисаяο в ρазделе 2а.
    [0021] 3. Κлοяжροвание в κлеτκаχ Ε. сοϊз. Κ-Ι2ЬΕΙ веκτορяыχ πлазмид ρΒΕ 322, яесущиχ в Ε ь I сайτе всτροен- - 5 - ные меτοдοм οлигο (άС)-οлигο (аο- ) κοняеκτοροв геяы ияτеρφеροна а) Пρисο.едияение κοннеκτοροв
    [0022] Οлигο (αС) κοяяеκτορы κ двуχцеποчечяοй Κ-ДΗΚ πρисοе- диняюτ следующжм οбρазοм.
    [0023] 20 мκл ρеаκциοянοй смеси сοдеρжиτ 140 мΜ κаκοдилаτ κалия 0,4 ιΜ κ-ДΗΚ τρансφ
    προдуκτ ρеаκции выделяюτ πο οπисаянοй в ρазделе 2а меτο- диκе.
    [0024] Οлигο (αб) κοннеκτορы κ ρасщеπленяοй ρесτρиκτазοй Ρз-Ы πлазмиде ρΒн 322 πρисοединяюτ следующим οбρазοм. 125 мκл ρеаκцжοняοй смеси сοдеρжиτ 200 ιΜ κаκοдилаτ
    ρΒκ 322, ρасщеπлеянοй ρесτρиκτазοй йьϊ, и 400 ед.аκτ. мл τеρминальнοй дезοκсинуκлеοτидилτρансφеρазы. Смесь инκу- биρуюτ в τечение 5 минуτ πρи 37° и προдуκτ синτеза выде- ляюτ κаκ οπисаяο в ρазделе 2а.
    [0025] Β уκазанныχ услοвияχ ρеаκций κ мοлеκуле двуχцеποчеч- яοй κ-ДΗΚ и ρасщеπлеянοй πлазмиды ρΒн 322 πρисοединжлοсь 15-20 мοяοмеρныχ едияиц аСΜΡ и <ιСΜΡ, сοοτвеτсτвеянο. б) Κлοниροвание ρеκοмбинанτныχ ДΗΚ в κлеτκаχ Ε. сοϋ Κ-Ι2 ннι,
    [0026] 20 мκл ρасτвορа 6 яг κ-ДΗΚ и 40 нг веκτορа, ποлучен- яыχ κаκ .οπисаяο в ρазделе За, в 10 мΜ τρис-ΗСЪ (ρΗ 7,5), 0,1 Μ ϊГаСϊ иϊй ЭДГΑ яагρеваюτ в τечение 10 минуτ πρи 65°, 2 часа πρи 42°, οχлаадаюτ в τечение 3 часοв дο 22° и исποльзуюτ для τρаясφορмации πο меτοду /Ба§ег1- м. е* аϊ., Сеηе, 1979, НΚ-Ι2 ΗΕϊ(-Ρ", ρгο,1еи,"Ыιϊ, Ιас
    Ι~") . Τаκим πуτем ποлучаюτ 1200 τеτρациκлия (5 мκг/мл) - усτοйчивыχ τρанс- φορмаτοв, из κοτορыχ 98 προявляюτ амπищшшн
    [0027] (150 мκг/мл) - чувсτвиτельнοсτь и исποльзуюτся для сκρининга ρеκοмбинаяτοв.
    [0028] 4» Οτбορ ρеκοмбжнанτяыχ ДΗΚ, яесущиχ гены лейκο-
    [0029] Ο^ΥιΡΙ - 6 - циτаρнοгο инτеρφеροна челοвеκа - а) Οτбορ ρеκοмбинаяτяыχ ДΗΚ, несущиχ гены лежκοцж- τаρяοгο инτеρφеροяа челοвеκа οсущесτвляюτ с ποмοщью
    [0030] 32ρ -мечеяыχ синτеτичесκиχ Ι6-членяыχ οлигοяуκлеοτид- ныχ зοядοв с ποследοваτельнοсτью άΤСΤСΑΤСΑΤΤΤСΤССΤ (Α) и αССΤСΤСΑΤСΤСССΤСΑ (Б) , κοмπлеменτаρяые χаρаκτеρным для бοлыπиясτва жзвесτныχ генοв леπκοциτаρяοгο инτеρφеροяа челοвеκа /&οе<Ιάе1 Б.ν. еЪ аϊ., ЫаЪиге,1981,290, 20-26/ κοнсеρваτивным учасτκам яуκлеοτждοв 504-519 κοдиρующей цеπи и нуκлеοτидοв 68-83 яеκοдиρующей цеπи, сοοτвеτсτвея- яο. Для введения 5ι--κοнцевοж меτκж 30 ммοль οлигοяуκлеο- τжда жнκубжρуюτ в τеченже 30 мжнуτ πρж 37° в 20 мκл ρе- аκциοннοи смеси, сοдеρжащей 50 мΜ τρис-ΗСЬ (ρΗ 8,0), 5 мΜ джτиοτρежτ, 7 Ш. м§С12, 3 мκΜ Χ"-^ 32Ρ ΑΤΡ ж 20 ед. аκτ. ποлжнуκлеοτждκжназы φага Τ^- 5 -[_ Ρ| -мечеяый οлж- гοнуκлеοτид οчищаюτ χροмаτοгρаφжей на- сеφадеκсе 050 (0,4-22 см) в Η^Ο. б) Гибρидизация κοлοний на нжτροцеллюлοзяыχ φильτρаχ с 5 - Ρ| мечеными οлигοнуκлеοτждяымж зοядами ϊсг Αρ3 τρансφορманτы выρащиваюτ на яжτροцеллюлοзныχ φжльτρаχ (φ 90 ш) дο ποявления κοлοяий, ποτοм φильτρы πеρенοсяτ на агаρ, сοдеρжащий χлορамφеяжκοл (500* мκг/мл) , ж προдοлжаюτ ияκубацию 18 часοз. Далее φильτρы οбρабаτы- ваюτ 0,5 н ΗаθΗс ποследующей яейτρализацией в I Μ τρис- -ΗСΙ (ρΗ 8,0) ж ваκуумнοй сушκοй (2-4 часа πρи 80°), ж προвοдяτ πρегибρндизацию φильτροв в τеченже 2 часοв πρи 37° в смеси, сοдеρжащей 0,15 Μ τρис-ΗСΙ (ρΗ 8,0), 0,75 Μ ΝаСΙ, 5 мΜ ЭПГΑ, I ιΜ ^ΗΡΟ^, 250 мκг/мл τ-ΡΗΚ ж дο- децжлсульφаτ наτρия, бычий сывοροτοчныж альбумин, φиκοд ж ποливинилπиροллидοя - πο 0,1$ κаждοгο. Пοсле προсушκж яа φильτροвальяοж бумаге φжльτρы смачжваюτ вышеуκазаянοж смесью 500 мκл/φильτρ/, еοдеρжащей Ι'ΙΟ6 имπ/мия/мл
    [0031] -οлигοяуκлеοτида, заπажваюτ в ποлиэτиленοвыи πаκеτ и инκубиρуюτ в τечеяие 20 часοв πρи 37°. Пοсле гжбρжджзацжи φильτρы πρж 22° τρжжды οτмываюτ ρасτвοροм 0,1 Μ τρжс-ΗСΙ ρΗ 8,0), 0,5 Μ ΕεС 0,1$ дοдецжлсульφаτ наτρжя, высушжваюτ ж авτοгρаφжρуюτ на ρеяτгеяοвсκοй πлея- - 7 - κе в τечеяие 20-70 часοв. Αвτορадиοгρаφия φильτροв вы- явила несκοльκο κοлοяий, ποлοжжτельныχ в гжбρидизацжи с οбеими 5 - Ρ] -мечеяыми οлигοнуκлеοτидными зοндами Α и Б. Ρесτρиκцжοнный анализ πлазмидяοй ДΗΚ из эτиχ κοлο- 5 нжй и аналжз нуκлеοτжднοж ποследοваτельнοсτи всτροеяяοй κ-ДΗΚ ποκазал, чτο οдна ρеκοмбинанτная ДΗΚ ρϊж Ю5 сοдеρжиτ κοροτκую ποследοваτельнοсτь 5 -неτρаяслиρуемοгο учасτκа, κοдиρующую ποследοваτельнοсτь ποлнοгο геяа че- лοвечесκοгο лейκοциτаρяοгο инτеρφеροяа нοвοгο вида лей-0 κοциτаρяοгο ияτеρφеροна И" ж 370 нуκлеοτждοв 3 -неτρан- слиρуемοи часτи геяа.
    [0032] 5. Κοясτρужροвание ρеκοмбинанτныχ ДΗΚ, οбесπечи- вающиχ синτез ияτеρφеροна Νв κлеτκаχ Ε СΟΙΪ а) Плазмида ρϊш Ι05-Ι , яесущая гея πρеияτеρφеροяа Ν ποд κοнτροлем 1; προмοτορа. ДΕЖ ρеκοмбияаяτяοй πлазмж- ды ρϊжϊθδ, сοдеρжащей вышеуποмянуτый гея инτеρφеροяа Ν, выделяюτ из лизаτа τρаясφορмиροваняыχ κлеτοκ Ε.сοϊχ и οчищаюτ на гидροκсиаπаτиτе πο извесτяοй меτοдиκе
    [0033] /Сοϊшаη Α. е-Ь аϊ. , σ.ΒϊοсΙηет.1978,_91, 303-310/ 50 ΜΚГ ДΗΚ οбρабаτываюτ ρесτρиκτазοй Ρз-ьΙ ж προдуκτы ρасщеπле- нжя ρазделяюτ элеκτροφορеτичесκи в 0,8% агаροзнοм геяе. Φρагменτ ДΗΚ /οκοлο 960 πаρ οснοванжй/, сοдеρжащий гея жнτеρφеροна, выделяюτ элеκτροэлюцией и οчжщаюτ κаκ οπи- санθ Β /Αηа1у1;.3-ΙοсЬет. 1981, 112, 295-298/. Ю ΜΚГ φρагмеяτа ДΗΚ ρасщеπляюτ ρесτρиκτазοй ΒатΗ I, смесь οб- ρабаτываюτ яуκлеазοй з-^/Ο^δ ед.аκτ./мκг ДΗΚ, 30 минуτ πρи 22°/ и бοлыποй ΒашΗ Ι-Ρз-ь I φρагменτ /947 πаρ οсяο- ваяий/ ποсле элеκτροφορеза в 1,5 агаροзяοм гене выделя- юτ аналοгичнο ΡεЬ I φρагмеяτу. 5 мκг веκτορяοй πлазмиды ρΒй322--Ьгρ /Οвчиняиκοв Ю.Α, и дρугие, ДΑΗ, 1982, 265, 238-242/, сοдеρжащей προмοτορ- яый учасτοκ τρиπτοφаяοвοгο οπеροна Ε. сοϋ, ρасщеπляюτ ρесτρиκτазοй Ε. сο. ц. , заποлняюτ лиπκже κοяцы ДΗΚ ποлж- меρазοй I /φρашеяτ Κлеяοва/ πο οπисаянοж меτοджκе /Засктаη Κ. е-Ь аϊ., Ρгοс.ΝаϊΙΑсаό .Зсι υЗΑ,1976,71,4171-4178/ 1,5 мκг веκτορа лигжρуюτ в τечение 18 часοв πρи 10° в 10 мκл буφеρа 50 мΜ τρис-ΗСΙ (ρΗ 7,6), 10 мΜ м§сϊ2, 10 мΜ диτиοτρежτ, сοдеρжащем 0,27 мκг φρа-πйеяτа ДΒΚ с
    [0034] У >ιУ ( ΟΜΡΙ - 8 - генοм жнτеρφеροяа ж 20 ед.аκτ. Τ^ ДΗΚ-лжгазы. Смесь ρаз- бавляюτ 150 мκл буφеρа 10 мΜ τρжс-ΗСΙ (ρΗ 7,5), 50 мΜ Ηаσϊ , I мΜ ЭЙГΑ ж τρаясφορмиρуюτ κлеτκи Κ.сοϋ Κ-Ι2ΕΕΙ. Τρаясφορманτы, сοдеρжащие гея ияτеρφеροна, οτбжρаюτ гжб- ρидизацией κοлοниж, κаκ οπисанο в ρазделв 46. Пρи ποмοщи ρесτρжκцжοянοгο аяалжза была идеяτиφициροвана πлазмида ρϊж Ι05-Ι, сοдеρжащая гея πρеияτеρφеροнаи ποд κοнτροлем τρиπτοφанοвοгο προмοτορа.
    [0035] Τρансφορлиροваняые ρϊж Ι05-Ι κлеτκи Ε.сοϋ Κ-Ι2Ε Ι в сρеде, сοдеρжащей (г/л): баκτοτρжπτοя - 10,0, дροажевοй эκсτρаκτ - 5,0,ιϊаСϊ - 10,0, амπициллин 0,02, выρащиваюτ дο οπτжчесκοй шюτяοсτи Αссд - Ι»0» οсаждаюτ ж ρазρушаюτ οбρабοτκοж лжзοцимοм и замορаживаяием - οττаиванием, κаκ
    [0036] ΟПЖСаяο Β /Жа-Ьиге, 1980, 284, 316-320/. Ακτивнοсτь инτеρφеροяа сοсτавляеτ 0,5 - 1,0 * ΙΟ6 ед.аκτ. яа I л баκτеρиальнοж сусπеязии. б) Плазмида эκсπρессиж зρелοгο инτеρφеροяа й"
    [0037] 5 мκг бοлыпοгο ΒатΗΙ-Ρз-ьΙ φρагменτа /ДΗΚ ρϊж 105/ ποдвеρгаюτ часτжчяοму гждροлизу' ρесτρиκτазοж ЗаиЗΑ /2 ед.аκτ./мκг ДΗΚ, 5 мжяуτ πρж 37°/» смесь φρаг- меяτοв ρазделяюτ элеκτροφορезοм в 1 ,5% агаροзнοм геле и выделяюτ φρаιменτ длжнοй в 869 нуκлеοτждοв, сοдеρжащжж ген зρелοгο жнτеρφеροна без πеρвοгο κοдοяа. Κ эτοг-лу φρагменτу πρисοединяюτ синτеτжчесκиж οлигοнуκлеοτид /ДΑΗ, 1982, 265, 238-212/ с ΕеοκΙ и Заи ЗΑ лишшми κοн- цами , лигиρуюτ πο Ρз-ь I и Εсο κϊ сайτам веκτορнοж πлаз- миды ρΒ 322. Ρеκοмбинанτнοй ДΗΚ τρаясφορмиρуюτ κлеτκж Ε.сοϋ и ποсле гибρидизацжи с зοядамж ж ρесτρжκцжοннοгο аяалжза ДΗΚ жз τρансφορманτοв οτбжρаюτ πлазмиду ρ-ШϊΙ8, яесущую мοдиφжцжροваяный ген зρелοгο жнτеρφеροяа н. Κο- ροτκий Εсο Εϊ - Ρа-Ь I φρаιменτ πлазмиды ρϊжϊδ с мοдиφи- циροваяным генοм ияτеρφеροяа лигиρуюτ с Ρνи II - Εсο нϊ φρагмеяτοм 340 πаρ οсяοваний/ ДΗΚ πлазмиды ρΒκ 322 --Ьгρ, несущим -Ьιρ-προмοτορ, и 0,4 мκг προдуκτа всτρаиваюτ πο Ρз-ь I и заποлненнοму ΕсοΕ I сажτу веκτορяοж πлазмиды ρΒн 322» Пοсле τρаясφορмацжж κлеτοκ Ε.сοϋ κκϊ οτбжρаюτ 1000 ΤсгΑρ8 κлοнοв, из κοτορыχ ποсле гибρидизациοянοгο и ρесτρжκцжοннοгο аяализа ρеκ^мбинанτны ДΗΚ οτбиρаюτ πлаз- - 9 - миду ρϊж 18-36, сοдеρжащую ποд κοяτροлем τρиπτοφаяοвοгο προмοτορа гея зρелοгο инτеρφеροна ιг.
    [0038] Βыχοд лейκοциτаρнοгο ияτеρφеροна Ν сοсτавляеτ 4-6*10 ед.аκτ. с I лиτρа баκτеρиальяοй сусπеязии. Пροмышленная πρименимοсτь
    [0039] Заявляемый лейκοциτаρный челοвечесκий инτеρφеροя Ν οбладаеτ προτивοвиρуснοй аκτивнοсτью и мοжеτ найτж πρи- меяение в медицияе в κачесτве анτжвиρусяοгο, анτжмжκροб- нοгο и προτивοοπуχοлевοгο сρедсτва.
    权利要求:
    Claims- 10 -ПΡЩЭДΕΤ Ш0БΡΕΤΕΗИЯ
    1. Ιейκοциτаρныж челοвечесκжй жнτеρφеροн υ , πρед- сτавляющий сοбοй белοκ сο следущеϊ аминοκислοτнοж ποсле- дοваτельнοсτью:
    5 σБЬΡдΤΗ5ЪСΙ*ΙΚΚΑЫЬЬΑς ΚΙ5ΗЗ,5σЬΚБΚ Бϊ,0ΡΡ Ε7 ΒαЗϊα ,д .дΑϊ5Α ЖΕΜϊςςΤ Ь 'δΕΚБδδ ГО ΤЬЬϋΚΡΥΙ ЬΡςд -'БЬΕ СνταΕνсνЗΕΙΑΙΜ ΞΒ5ΙΙΑν Εα ΙΤЬ ^σшα'5ΡσΑ!ΑΕννΚ ΞΙШ , 5,5Τ ЬдΚСЬΚΚΚΒ
    2. Сποсοб ποлучения лейκοциτаρяοгο челοвечесκοгο0 инτеρφеροна И" πο π.Ι в баκτеρжальяыχ κлеτκаχ, вκлючающжй выделение маτρичнοй ποли (Α)-м-ΡΗΚ из иядуцжροваяныχ лей- κοциτοв челοвеκа, синτез геяа ияτеρφеροна, всτρаиваяие в веκτορную πлазмиду ρΒΕ 322 ποд κοяτροлем τρиπτοφаяοвο- гο προмοτορа и τρаясφορмациго ποлучеяяοй ρеκοмбияанτнοй5 ДΗΚ κлеτοκ баκτеρиж Ε. сοϋ , χаρаκτеρжзующжжся τем, чτο в κачесτве гена ияτеρφеροяа исποльзуюτ ген жяτеρφеροяа сο еледующеж πеρвжчнοй сτρуκτуροй ДΗΚ: τστ σ-ΑΤ στσ σστ σдσ Αστ σдσ Αασ στσ σστ ΑΑΓ Ασσ Ασσ с-σσ τισ ΑΓΑ στσ στσ σσд ΟΑΑ ΑΤС σσд ΑΟ-Α ΑΤΟ τστ σдг ττσ τσσ0 τσσ στσ ΑΑС Ο-ΑΟ ΑСΑ ΤΑΤ СΑΤ ττσ αα-Α ττσ σσσ σдσ СΑС στσ τττ СΑΤ σσσ ΑΑ σдσ ττσ σΑσ ΑΑС αστ Ο Α ασσ дτσ гστ σσσ •ττσ σΑΤ Сσ Ατα ΑΤΟ σдσ σдσ ΑΟΟ гτσ ΑΑΤ στσ ττσ ΑСΟ Ασд ΑΑС σΑΤ ΤΟΑ τστ αστ σστ τσσ σ-ΑΤ σдσ Ασσ στσ СΤΑ σдσ ΑΑΑ гτσ ΤΑΟ ΑΤΤ СΑΑ σττ ττσ σлσ ΟΑΑ σгσ ΑΑΤ ΟΑС СΤΑ СΑΑ σсσ5 гστ στσ ΑΟΑ ΟΑС СΑС σττ σσσ στα αдд СΑС ΑΤΓ σσσ σгσ ΑΤС ΑΑΤ σ σдσ τσσ дτσ στσ σστ στσ Ασσ ΑΑΑ ΤΑΟ τ-ττ σΑΑ ΑСΑ Ατσ ΑΟΤ σττ ΤΑΤ στσ Αгσ σσσ ΑΑσ ΑΑΑ ΤΑС дσσ σστ τστ σσс τσσ στг στσ ΑСΑ ΟΟΑ &ΑΑ ΑΓΟ Αгσ Α&Α гοσ ττσ τστ гττ ΤΟΑ ΑΟΑ ΑΑΟ ττσ ΟΑΑ ΑΑΑ σσд ΤΤΑ Αд Ασσ σ Τ
    -Ъ ϊ гΕΑϊ
    类似技术:
    公开号 | 公开日 | 专利标题
    US20190016781A1|2019-01-17|Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
    JP2019030327A|2019-02-28|ヒト疾患に関連する生物製剤およびタンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド
    Hashimoto et al.2015|MitoTALEN: a general approach to reduce mutant mtDNA loads and restore oxidative phosphorylation function in mitochondrial diseases
    JP6348482B2|2018-06-27|タンパク質のインビボ産生
    US10603365B2|2020-03-31|Clostridium histolyticum enzymes and methods for the use thereof
    Bi et al.1991|FtsZ ring structure associated with division in Escherichia coli
    Gershwin et al.1987|Identification and specificity of a cDNA encoding the 70 kd mitochondrial antigen recognized in primary biliary cirrhosis.
    Grentzmann et al.1994|Localization and characterization of the gene encoding release factor RF3 in Escherichia coli
    Rübenhagen et al.2000|Osmosensor and osmoregulator properties of the betaine carrier BetP from Corynebacterium glutamicum in proteoliposomes
    Ohnuma et al.1974|Microbiological assay of bleomycin: inactivation, tissue distribution, and clearance
    Graw1997|The crystallins: genes, proteins and diseases
    Meier et al.1985|Antigenic variation is associated with DNA rearrangements in a relapsing fever Borrelia
    Fernández-Cañón et al.1995|Molecular characterization of a gene encoding a homogentisate dioxygenase from Aspergillus nidulans and identification of its human and plant homologues
    Conti et al.1999|Cultures of astrocytes and microglia express interleukin 18
    JP5902679B2|2016-04-13|ＩＬ−４Ｒαに結合する涙液リポカリンムテイン
    Garcia et al.2008|Isolation, synthesis, and antimicrobial activities of naturally occurring θ-defensin isoforms from baboon leukocytes
    Estévez et al.1999|Uridine insertion/deletion RNA editing in trypanosome mitochondria—a review
    CA1341426C|2003-04-01|Process for the manufacture of thrombin inhibitors
    JP2687995B2|1997-12-08|Ｄｎａ配列、組替えｄｎａ分子およびヒト繊維芽細胞インターフェロン様ポリペプチドの製造方法
    Ouellette et al.1994|Mouse Paneth cell defensins: primary structures and antibacterial activities of numerous cryptdin isoforms.
    EP0234888B1|1993-05-19|Process for producing human epidermal growth factor and analogs thereof
    WO2016201377A1|2016-12-15|Targeted adaptive vaccines
    FI114398B|2004-10-15|Kasvain-nekroositekijän | inhibiittoria koodittava yhdistelmä-nukleiinihapposekvenssi, menetelmä yhdistelmä-kasvainnekroositekijä-|-inhibiittorin valmistamiseksi, menetelmässä käyttökelpoinenvektori ja yhdistelmäisäntäsolu
    CN1087344C|2002-07-10|转化生长因子α－H1
    Worland et al.1989|Inducible overexpression, purification, and active site mapping of DNA topoisomerase II from the yeast Saccharomyces cerevisiae.
    同族专利:
    公开号 | 公开日
    JPS60500574A|1985-04-25|
    GB8426019D0|1984-11-21|
    US4751287A|1988-06-14|
    GB2150573A|1985-07-03|
    DE3490055T0||
    SE8404803D0|1984-09-25|
    SE8404803L|1984-09-25|
    SE453512B|1988-02-08|
    DE3490055T1|1985-05-02|
    FR2541579A1|1984-08-31|
    GB2150573B|1987-11-11|
    FR2541579B1|1987-12-18|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    WO1980002375A1|1977-09-23|1980-11-13|Hem Res Inc|High purity animal interferons|
    GB2116566A|1982-03-08|1983-09-28|Genentech Inc|Animal interferons and processes for their production|
    EP0099084A2|1982-07-12|1984-01-25|F. HOFFMANN-LA ROCHE &amp; CO. Aktiengesellschaft|Verfahren zur Herstellung von Interferon und Expressionsvektoren dafür|WO1985002862A1|1983-12-23|1985-07-04|Monash University|PRODUCTION OF HUMAN INTERFERON-alpha|CH657141A5|1980-07-01|1986-08-15|Hoffmann La Roche|Dns-sequenzen, rekombinante expressionsvektoren zur mikrobiellen herstellung von human-leukozyten-interferonen und transformierte mikroorganismen.|
    US4414150A|1980-11-10|1983-11-08|Genentech, Inc.|Hybrid human leukocyte interferons|
    ES506955A0|1980-11-10|1983-02-01|Genentech Inc|Un procedimiento para producir un polipeptido antiviral.|
    EP0072541A3|1981-08-14|1984-04-18|F. HOFFMANN-LA ROCHE &amp; CO. Aktiengesellschaft|Human leukocyte interferons, process for their microbial production, intermediates therefor and compositions containing them|EP0154186B1|1984-02-10|1992-07-22|Cytoclonal Pharmaceutics Inc.|Isolation of a novel interferon gene and expression thereof|
    FR2821625B1|2001-03-01|2003-05-16|Genodyssee|Nouveaux polynucleotides comportant un polymorphisme de type snp fonctionnel dans la sequence nucleotidique du gene ifn-alpha-2 ainsi que de nouveaux polypeptides codes par ces polynucleotides et leurs utilisations therapeutiques|
    FR2823220B1|2001-04-04|2003-12-12|Genodyssee|Nouveaux polynucleotides et polypeptides de l'erythropoietine |
    法律状态:
    1984-08-30| AK| Designated states|Designated state(s): DE GB JP SE US |
    1985-05-02| RET| De translation (de og part 6b)|Ref document number: 3490055 Country of ref document: DE Date of ref document: 19850502 |
    1985-05-02| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 3490055 Country of ref document: DE |
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    SU3562850||1983-02-24||GB8426019A| GB2150573B|1983-02-24|1984-02-23|Leukocytic human interferon n and method to obtain it in bacterial cells|
    [返回顶部]